16 tipo ŽPV po gydymo

Susiję ir rekomenduojami klausimai

18 atsakymų

Raskite puslapį

Ką daryti, jei turiu panašų, bet skirtingą klausimą?

Jei neradote informacijos, kurios jums reikia norint atsakyti į šį klausimą, arba jei jūsų problema šiek tiek skiriasi nuo aukščiau pateiktos, pabandykite užduoti gydytojui šį klausimą šiame puslapyje, jei jis susijęs su pagrindiniu klausimu. Taip pat galite užduoti naują klausimą, į kurį po kurio laiko atsakys mūsų gydytojai. Tai taip pat nemokama. Panašią informaciją taip pat galite rasti šiame puslapyje arba svetainės paieškos puslapyje. Mes esame labai dėkingi, jei rekomenduosite mus socialiniuose tinkluose savo draugams.

„Medportal 03online.com“ Vykdykite medicinines konsultacijas pagal vietinius gydytojus. Čia rasite tikrų jūsų regiono ekspertų atsakymus. Šiuo metu šalyje konsultuojamasi dėl 45 sričių: alergijos specialistų, venerologijos, gastroenterologijos, hematologijos ir genetikos, ginekologo, homeopato, dermatologo vaikų ginekologo vaikų neurologijos, pediatrijos, chirurgijos, pediatrijos, endokrinologų, dietologų, imunologijos, infekcinių ligų, infekcinių ligų, infekcinių ligų, Logopedė Laura, mamologė, gydytoja, teisininkė, narkologė, neuropatologė, neurochirurgas, nefrologas, onkologas, onkologas, ortopedas, oftalmologas, pediatras, plastikos chirurgas, proktokologas, psichiatras, psichologas, pulmonologas, reumatologas, seksologas ir urologas, farmacininkas, fitoteralebitas. Chirurgas, endokrinologas.

Atsakome į 94,79% klausimų.

RU2492240C2 – stabilizuotas aukšto ekspresijos vektorius ŽPV vakcinai ir rekombinantinėms pieno rūgšties bakterijoms, transformuotoms šiuo vektoriu, – „Google Patents“

rūšiuoti

  • C – CHEMIJA; METALURGIA
  • C12 – BIOCHEMISTIKA; PIVO; dvasios; vyno; actas; mikrobiologija; enzimoloģijā; Mutacija arba genų inžinerija
  • C12N – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS ŽINIASKLAIDA
  • C12N15 / 00 – mutacija arba genetinė inžinerija; Genetiškai susieta DNR arba RNR, vektoriai, pvz. Plazmidės arba jų išskyrimas, paruošimas ar gryninimas; Tam naudokite šeimininkus
  • C12N15 / 09 – Rekombinantinės DNR technologija
  • C12N15 / 63 – svetimos genetinės medžiagos įvedimas naudojant vektorius; vektoriai; Šeimininkų naudojimas šiam tikslui; Išraiškos kontrolė
  • C12N15 / 74 – E. coli, pvz. Lactobacillus, mikromonospora
  • C12N15 / 746 – E. coli, pvz. Lactobacillus, mikromonospora pieno rūgšties bakterijoms (Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Propionibacterium, Bifidobacterium, Sporolactobacillus)
    • A – ŽMOGAUS POREIKIAI
    • A61 – MEDICINOS AR GYVŪNŲ MOKSLAS; higiena
    • A61K – preparatai medicinos, stomatologijos ar tualeto reikmėms
    • A61K39 / 00 – vaistai, turintys antigenų ar antikūnų
    • A61K39 / 12 – virusiniai antigenai
      • A – ŽMOGAUS POREIKIAI
      • A61 – MEDICINOS AR GYVŪNŲ MOKSLAS; higiena
      • A61K – preparatai medicinos, stomatologijos ar tualeto reikmėms
      • A61K39 / 00 – vaistai, turintys antigenų ar antikūnų
      • A61K2039 / 51 – Medicininiai virusai / DNR / RNR virusai
      • A61K2039 / 52 – bakterijų ląstelės; Grybelių ląstelės; pirmuonių
      • A61K2039 / 523 – bakterijų ląstelės; Grybelių ląstelės; Protozoinų ląstelės, išreiškiančios pašalinius baltymus
        • A – ŽMOGAUS POREIKIAI
        • A61 – MEDICINOS AR GYVŪNŲ MOKSLAS; higiena
        • A61K – preparatai medicinos, stomatologijos ar tualeto reikmėms
        • A61K39 / 00 – vaistai, turintys antigenų ar antikūnų
        • A61K2039 / 54 – Vaistų siūlymas pagal naudojimo būdą
        • A61K2039 / 541 – gleivinės
        • A61K2039 / 542 – burnos ar virškinimo trakto užraktas
          • C – CHEMIJA; METALURGIA
          • C12 – BIOCHEMISTIKA; PIVO; dvasios; vyno; actas; mikrobiologija; enzimoloģijā; Mutacija arba genų inžinerija
          • C12N – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS ŽINIASKLAIDA
          • C12N2710 / 00 – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS MEDIJOS dsDNA virusai
          • C12N2710 / 00011 – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS ŽINIASKLAIDA dsDNA virusai dsDNA virusai
          • C12N2710 / 20011 – papilomos viridae
          • C12N2710 / 20034 – viruso ar viruso komponento naudojimas kaip vakcina, pvz. gyvi sutrikę ar inaktyvuoti virusai, VLP, virusiniai baltymai
            • C – CHEMIJA; METALURGIA
            • C12 – BIOCHEMISTIKA; PIVO; dvasios; vyno; actas; mikrobiologija; enzimoloģijā; Mutacija arba genų inžinerija
            • C12N – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS ŽINIASKLAIDA
            • C12N2710 / 00 – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS MEDIJOS dsDNA virusai
            • C12N2710 / 00011 – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS ŽINIASKLAIDA dsDNA virusai dsDNA virusai
            • C12N2710 / 20011 – papilomos viridae
            • C12N2710 / 20041 – viruso dalelės arba viruso elementai kaip vektoriai
            • C12N2710 / 20045 – speciali tikslinė sistema virusiniams vektoriams
              • C – CHEMIJA; METALURGIA
              • C12 – BIOCHEMISTIKA; PIVO; dvasios; vyno; actas; mikrobiologija; enzimoloģijā; Mutacija arba genų inžinerija
              • C12N – MIKROORGANIZMAI ARBA ENZIMAI; JŪSŲ SUDĖTIS; MIKROORGANIZMŲ APSAUGA, APSAUGA IR PRIEŽIŪRA; Mutacija arba genų inžinerija; KULTŪROS ŽINIASKLAIDA
              • C12N2810 / 00 – vektoriai, nukreipti į grupę
              • C12N2810 / 50 – atramos, gaunamos iš apibrėžtų baltymų
              • C12N2810 / 55 – tikslinės bakterijos, gaunamos iš medžiagos
              • aprašymas

                Šis išradimas yra susijęs su paviršinės ekspresijos vektoriais, skirtais gaminti terapines žmogaus papilomos viruso (ŽPV) vakcinas, kur paviršinio ekspresijos vektorius apima geną, sudarytą iš mutavusio repE baltymo, turinčio SEQ ID Nr. 1 aminorūgščių seką, promotoriaus, sudėtingos gliutamato sintazės ir genas, susietas su poligamaglutamato komplekso genų sintezės genu ir koduojantis antigeninį žmogaus papilomos viruso žmogaus virusą, susijusį su naviko indukcija.

                Yra žinoma, kad pašalinių baltymų, naudingų užsienio baltymų masėms ekspresuoti, gamyba priklauso nuo genų kopijų skaičiaus, tai yra nuo plazmidžių skaičiaus ir promotoriaus, naudojamo transkripcijai nukreipti, skaičiaus. Buvo pranešta, kad tikslinio baltymo ekspresija padidėja keičiant plazmidžių vektorius kiekvienoje bakterijoje, be paprastai naudojamo aukštos ekspresijos promotoriaus (Tomio, M. et al., Appl Microbiol Biotechnol 28: … 170, 1988). ). Jie taip pat pranešė, kad mutacijos, esančios mini-F plazmidėje, gali pakeisti plazmidžių skaičių skirtingose ​​bakterijose (Yasuo, K. ir kt., J. Biol Chem., 267: 11520, 1992).

                Apskaičiuotas žmogaus papilomos virusas (ŽPV) užkrėtė daugiau nei 50% suaugusių žmonių visame pasaulyje. Visų pirma tikimasi, kad keturi ŽPV tipai, įskaitant ŽPV 16, 18, 31 ir 45, sukels daugiau nei 80% gimdos kaklelio vėžio atvejų (Lowy, DR ir kt., Proc Nat Acad Sci, 91: … 2436). , 1994)). ).

                Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, gimdos kaklelio vėžys yra antras dažniausiai pasitaikantis vėžys po krūties vėžio, tačiau visame pasaulyje kiekvienais metais buvo nustatyta daugiau nei 500 000 naujų gimdos kaklelio vėžio atvejų ir daugiau nei 300 000 pacientų. Miršta nuo gimdos kaklelio vėžio. Gimdos kaklelio vėžys yra viena pagrindinių moterų mirties priežasčių, ypač besivystančiose šalyse (Pisani, P., et al., Int. Cancer, 55: 891, 1993). IARC ataskaita parodė, kad lėtiniu ŽPV infekuotų pacientų skaičius besivystančiose šalyse yra daug didesnis nei išsivysčiusiose šalyse, o veiksmingiausias būdas ŽPV infekcijai likviduoti yra profilaktinės vakcinos nuo ŽPV.

                Kuriant gimdos kaklelio vėžio vakcinas daugiausia dėmesio buvo skiriama dviejų rūšių profilaktinėms ir terapinėms vakcinoms. Profilaktinių vakcinų tikslas yra stipresnis neutralizuojantis ŽPV L1 / L2 antigeno antikūnas, kuris šeimininkui leidžia užkirsti kelią užsikrėtimui ŽPV apsauga ir užkirsti kelią ligos progresavimui, net jei jis jau yra užkrėstas. Kita vertus, terapinė vakcina, nukreipta prieš ŽPV E6 / E7, nukreipta į specifinį ląstelių imuninį atsaką, kuris nustato pažeidimus ar sunaikina piktybinius navikus.

                Kadangi ŽPV E6 / E7 specifinio antigeno baltymas yra skirtas vėžiui, susijusiam su ŽPV užkrėstų ląstelių kancerogeneze, tolesni baltymo E6 / E7 taikymo kaip imunoterapijos nuo gimdos kaklelio vėžio tikslai. Tiesą sakant, jie pranešė, kad pelėms, kurios užkrėtė navikines ląsteles, buvo slopinamas arba atidėtas ŽPV E6 / E7 baltymas, sintetinamas mikrobų sistemoje (Gao, L. ir kt. J. Gen. Violet., 75: 157). 1994, Meneguzzi, G. ir kt., Virology, 181: 62, 1991). Tačiau kai naudojamos gyvos viruso vakcinos, kaip ir kitais atvejais, gali kilti problemų dėl per didelio viruso pagausėjimo. Todėl gyvos virusinės vakcinos, daugeliu atvejų naudojamos tik mokslinių tyrimų tikslams, yra nepalankios būklės, nes rinka ilgai veikia ir reikalauja didelių klinikinių tyrimų.

                Nors veikliąją medžiagą lydi vakcinos, įskaitant bakterijų vektorių, kūrimas, ir pranešama, kad susilpnintame Salmonella tifimurijuje susintetinta ŽPV-16 VLP, kuri slopina antigenui specifinių antikūnų susidarymą gleivinėse ar visoje Pelių kūnas (Denis, N. et al., Infection and Immunity 65 (1997), 3328). Dėl sintetinių peptidų vakcinų bus sintetinami tik tie epitopai, kurie yra būtini imuniniam atsakui paveikti, ir tie epitopai, kurie sukelia citotoksinį T limfocitų atsaką (CTL) į ŽPV 16 E6 / E7, kurie jau yra žinomi (Ressing; ME). et al., J. Immunol., 154: 5934, 1995).

                Be šių eksperimentų, transgeninių augalų (gaunamų iš daržovių, įskaitant pomidorus ir bulves), kaip geriamųjų ar valgomųjų vakcinų, naudojamų virusiniams antigenams gaminti augaluose, panaudojimo tyrimai. Tipiški tokių vakcinų pavyzdžiai yra hepatito B antigeno paviršiaus dalelės (Thavala, YF ir Artzen, CJ, Pro Natl Acad Sci USA, 92: 3358, 1995), ir kapsido baltymas bei papilomos virusas L1 ir L2 (Fig. Korėjos registracijos numeris (tačiau augalų sistemos turi komercinio naudojimo problemų, kurias riboja žemas išreikštų ŽPV L1 baltymų kiekis ir problemos, susijusios su gryninimu.

                Žmonių, užsikrėtusių ŽPV, dauguma yra besivystančiose šalyse, todėl būtina skubiai sukurti ekonomiškai efektyvų ir stabilų ŽPV antigenų gamybos procesą, siekiant užkirsti kelią burnos ar lytinių organų vėžiui ir jį gydyti. kurį sukelia papilomos virusas.

                Išradėjai anksčiau sukūrė vektorių, skirtą efektyviam ŽPV baltymo antigeno ekspresijai ant transformuotų rekombinantinių mikroorganizmų paviršiaus, ir metodą, skirtą ŽPV baltymo antigenui ekspresuoti mikroorganizmų paviršiuje (Korėjos patentas Nr. 0609.866).

                Atitinkamai, šio išradimo išradėjai dėjo daug pastangų, norėdami sukurti transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų paviršiuje vektorių, kuris galėtų stabiliai ir konstituciškai ekspresuoti ŽPV antigeno baltymus transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų paviršiuje, ir nustatė, kad stabilesnis ŽPV antigenas yra išreikštas didelėmis rekombinantinių mikroorganizmų koncentracijomis. transformuota šiuo vektoriu. kuris apima mutavusį repE geną ir taip užbaigia šį išradimą.

                Pagrindinis šio išradimo tikslas yra pateikti vektorių, galintį stabiliai ir konstruktyviai ekspresuoti didelius ŽPV baltymo antigeno kiekius transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų paviršiuje, panaudojant mutantines geno uodegas.

                Kitas šio išradimo tikslas yra pateikti rekombinantines pieno rūgšties bakterijas, transformuotas ekspresijos vektoriu, ir būdą, kaip gaminti ŽPV antigeno baltymą, naudojant pieno rūgšties bakterijas.

                Kitas šio išradimo tikslas yra pateikti vakciną gimdos kaklelio vėžiui gydyti, apimančią šias transformuotas rekombinantines pieno rūgšties bakterijas.

                Aukščiau išvardintiems tikslams pasiekti šis išradimas pateikia paviršiaus ekspresijos vektorių, apimantį: mutavusį repE geną, turintį SEQ ID Nr. 1 aminorūgščių seką; promotorius; Kompleksas yra sudėtingas genas, poli-gama-gliutamato sintetazė ir genas, susietas su sudėtiniu genomo sintetazės poli-gama-gliutamatu ir koduojantis žmogaus baltymų antigenus, papilomos virusą, norint sukelti naviką. prijungtas.

                Šis išradimas taip pat pateikia rekombinantinį mikroorganizmą, transformuotą vektoriu.

                Šis išradimas taip pat pateikia vakciną gimdos kaklelio vėžiui gydyti, apimančią rekombinantinį mikroorganizmą kaip aktyvųjį ingredientą, apimantį jo paviršiuje išreikštą į ŽPV antigeną panašų baltymą.

                Šis išradimas taip pat pateikia mikroorganizmo, turinčio ŽPV antigeną, išreikštą jo paviršiuje, pagaminimo procesą, procesą sudaro šios stadijos: rekombinantinis mikroorganizmas, transformavęs ŽPV vektorių ekspresijos kultūras mikroorganizmo paviršiuje. ; ir rekombinantinio mikroorganizmo, apimančio ŽPV antigeną, išreikštą jo paviršiuje, kolekcija.

                Šis išradimas taip pat pateikia gimdos kaklelio vėžio gydymui skirtą vakciną, kurioje kaip aktyvus ingredientas yra mikroorganizmas, gautas iš aukščiau aprašyto metodo ir turinčio ŽPV antigeną, ekspresuojamą jo paviršiuje.

                Trumpas skaičių aprašymas

                1 paveiksle parodytas pKV Pald-PgsA amilazės skilimo žemėlapis, į kurį mes įvedėme mutanto repE geną.

                2 paveiksle parodytas dviejų tipų ekspresijos vektorių, ekspresuojančių E7 geną, pasiskirstymo žemėlapis ant mikroorganizmų paviršiaus.

                3 paveiksle pavaizduoti Western blot analizės rezultatai E7 ekspresijai pieno rūgšties bakterijų, transformuotų pKV-Pald-PgsA-E7, paviršiuje.

                4 paveiksle pavaizduota pelės pieno rūgšties bakterijų įsisavinimo schema, skirta ištirti transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų, ekspresuojančių E7 ant jų paviršiaus, sugebėjimą sukelti imuninį atsaką.

                5 paveiksle parodyti IgG ir IgA pokyčiai, išgėrus transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų, ekspresuojančių E7 ant jų paviršiaus.

                6 paveiksle pavaizduoti E7 specifinės IFN-gama sekrecijos analizės rezultatai, kai peroraliai įvedamos transformuotos rekombinantinės pieno rūgšties bakterijos, ekspresuojančios E7 ant jų paviršiaus.

                7 paveiksle parodyti naviko naviko analizės, atliktos išgėrus transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų, ekspresuojančių E7 ant jų paviršiaus, rezultatai ir nustatant, ar naviko dydis didėja.

                8 pav. Parodytas ekspresijos vektoriaus, išreiškiančio geną E7 (Rb), pasiskirstymo žemėlapis ant mikroorganizmų paviršiaus.

                9 paveiksle parodyti E7 (Rb) ekspresijos analizės rezultatai ant pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb) transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų paviršiaus.

                10 paveiksle parodyti specifinio E7 imunologinio tyrimo (ELISA) rezultatai.

                11 pav. Parodyti IFN gama sekrecijos E7 (Rb) analizės rezultatai, išgėrus transformuotų rekombinantinių pieno rūgšties bakterijų, ekspresuojančių E7 ant jų paviršiaus.

                Pirmasis išradimo aspektas yra susijęs su paviršiaus ekspresijos vektoriu, apimančiu: mutavusį repE geną, koduojantį SEQ ID Nr. 1 aminorūgščių seką; promotorius; Kompleksas yra sudėtingas genas, poli-gama-gliutamato sintetazė ir genas, susietas su sudėtiniu genomo sintetazės poli-gama-gliutamatu ir koduojantis žmogaus baltymų antigenus, papilomos virusą, norint sukelti naviką. prijungtas.

                Šiame išradime modifikuotos mikroorganizmų mutantinės uodegos, koduojančios SEQ ID NO aminorūgščių seką: 1, kurios stabiliai gali būti išlaikytos transformuotuose mikroorganizmuose kartu su promotoriumi aldolaze (Palden), gautais iš geno Aldolase Lactobacillus casei. Todėl padidėjo tikslinio baltymo ekspresija mikroorganizmuose. Norėdami patvirtinti, kad šio išradimo šatralni vektorius stabiliai išsilaiko rekombinantiniuose mikroorganizmuose ir kad tikslinis baltymas yra ekspresuojamas rekombinantiniuose mikroorganizmuose, amilazės genas įterpiamas kaip taikinio genas rekombinantiniuose mikroorganizmuose ir analizuojant amilazės ekspresiją rekombinantiniuose mikroorganizmuose.

                Be to, tiriant tikslinį baltymą paviršiuje, genas su sudėtiniu poliggammos-gliutamato sintetazės motyvu yra išdėstytas ant paviršiaus taip, kad jis būtų ekspresuojamas tokiu pavidalu, kuris susijęs su tiksliniu baltymu. Šiuo atveju komplekso geno poligamma-glutamato sintetazė yra geriau pgsBCA ir dar geriau pgsA (Korėjos patento paraiška Nr. 469800).

                Viename šio išradimo įgyvendinimo variante genas, koduojantis HPV16 E7, yra prijungtas prie pgsA taip, kad HPV16 E7 baltymas kaip tikslinis baltymas yra prijungtas prie PgsA C-galo, kad sudarytų pKV Pald PgsA E7 vektorių kuriuos galima konstituciškai išreikšti. ŽPV antigeno baltymas pieno rūgšties bakterijų paviršiuje. Ekspresijos vektorius taip pat buvo įterptas į Lactobacillus casei, kad būtų pagamintos transformuotos rekombinantinės pieno rūgšties bakterijos, ekspresuojančios ŽPV antigeno baltymą.

                Čia vartojamas terminas "Tikslinio baltymo" arba "pašaliniai baltymai" Terminas „baltymas“ reiškia baltymą, kuris paprastai nerandamas transformuotose ląstelėse šeimininkėse, kurios išreiškia baltymą. Pvz., Kai manipuliuojama tuo, kad pieno arba naviko šaltinio baltymai yra dirbtinai ekspresuojami pieno rūgšties bakterijose, baltymas yra vadinamas pašaliniu baltymu arba tiksliniu baltymu.

                Kitas aspektas – šis išradimas susijęs su rekombinantiniu mikroorganizmu, transformuotu su vektoriu, rekombinantiniu mikroorganizmu, kurio paviršiuje yra ŽPV baltymo antigenas, ir su gimdos kaklelio vėžio gydymui skirta vakcina, kuri rekombinantinį mikroorganizmą paverčia aktyviu ingredientu. ,

                Čia vartojamas terminas "kariuomenė"arba "organizmai" reiškia pieno rūgšties bakterijas, kurios yra probiotinės gramneigiamos bakterijos, ir bendrieji probiotinių mikroorganizmų atrankos kriterijai apima: (i) žmogaus organizme gaunamą mikroorganizmą; (Ii) atsparumas tulžiui, rūgštims, fermentams ir deguoniui; (Ii) gebėjimas sulaikyti žarnyno gleivinę; (Iv) kolonizacijos galimybė žmogaus virškinimo trakte; (V) antimikrobinių medžiagų paruošimas; ir (VT) akivaizdus efektyvumas ir sauga. Šie kriterijai leidžia suprasti, kad pieno rūgšties bakterijos yra draugiškos ir nekenksmingos žmogaus organizmui. Kai žmogaus kūnas transformuoja pieno rūgšties bakterijas, naudojamas genų pernešimui, arba baltymai yra naudojami ligų prevencijai ar gydymui, skirtingai nuo įprasto metodo, naudojamo skiepyti bakterijų padermių gamybai, nereikia detoksikuoti fazinių bakterijų padermių.

                Šiame išradime pieno rūgšties bakterijos, naudojamos kaip šeimininkai, apima Lactobacillus sp. Streptococcus sp. ir Bifidobacterium sp. Paprastai Lactobacillus sp. Tai apima L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. delbrückii, L. johnsonii, L. reuteri ir L. bulgaricus, vadinamus Streptococcus sp. apima S. thermophilus ir Bifidobacterium sp. B. Infantis, B. Bijidum, B. Longum, B. Pseudolongum, B. Breve, B. Lactis Bb-12 ir B. Adolescentis. Pageidautina, kad Lactobacillus sp.

                Kitas išradimo aspektas yra susijęs su mikroorganizmo, apimančio ŽPV, išreikštą jo paviršiuje, pagaminimo būdu, būdą apimantį šiuos etapus: rekombinantinio mikroorganizmo transformavimą vektoriu, kad būtų galima ekspresuoti ŽPV antigeną ant mikroorganizmo paviršiaus , taip pat rekombinantinio mikroorganizmo, kuriame yra ŽPV antigeno, kolekcija. išreikštas jo paviršiuje.

                Rekombinantinių mikroorganizmų auginimas pagal šį išradimą gali būti vykdomas žinomu metodu ir tinkamai kontroliuojamos auginimo sąlygos, įskaitant temperatūrą ir augimo laiką, ir terpės pH. Rekombinantinės mikrobų ląstelės iš kultūros skysčio gali būti renkamos įprastais išskyrimo būdais, pavyzdžiui, centrifuguojant arba filtruojant.

                Kitas šio išradimo aspektas susijęs su gimdos kaklelio vėžio vakcina, kurioje kaip aktyvus ingredientas yra mikroorganizmas, gautas šiuo metodu, ir kurio paviršiuje yra ŽPV antigenas.

                Be to, šis išradimas susijęs su vakcina gimdos kaklelio vėžiui gydyti, skiriama peroraliai.

                Vakcinos yra vaistai, kuriuose gyvi organizmai naudojami siekiant užkirsti kelią ligoms ir stimuliuoti imuninę sistemą. Imunoaktyvacija – tai veiksmingas antigenų pašalinimo procesas, organizme gaminant antikūnus, stimuliuojant T limfocitus arba stimuliuojant kitas imunines ląsteles (pvz., Makrofagus). Ekspertai supranta išsamų imunologijos, susijusios su tokiomis detalėmis, tyrimą (Barrett J. T., Immunology Textbook, 1983). Vakcina su transformuotu mikroorganizmu, išreiškiančiu tikslinį baltymą kaip antigeną, gali būti skiriama žinduoliui, geriau žmogui.

                Vakcina gali būti suleidžiama pagal įprastus metodus. Vartoti tinkama dozė priklauso nuo genų produktų antigeniškumo ir gali būti tokia pati, kai vakcina gali efektyviai sukelti specifinį imuninį atsaką. Dozę galima lengvai nustatyti atliekant įprastas eksperimentines procedūras. Įprasta pradinė vakcinos dozė yra 0,001–1 mg antigeno / kg kūno svorio. Prireikus dozę galima padidinti, kad būtų užtikrintas palankus apsaugos lygis, arba skiepyti keletą kartų. Dozę gali nustatyti šios srities specialistai ir ji gali skirtis priklausomai nuo paruošimo būdo, vartojimo metodo, paciento amžiaus, kūno svorio, lyties, ligos sunkumo, dietos, vartojimo dažnio, vartojimo būdo, išsiskyrimo laipsnio ir jautrumo.

                Geriausias išradimo paviršiaus ekspresijos vektoriaus variantas, skirtas gaminti ŽPV vakciną, koduojančią E7 antigeno baltymą HP7. Vektorius, apimantis geno, koduojančio mutantinį artišoko baltymą, turinčio aminorūgščių seką SEQ ID Nr. 1, paviršiaus išraišką; aldolazės promotorius, gaunamas iš pieno rūgšties bakterijų; kompleksinį poligamama-glutamato sintetazės geną, parinktą iš grupės, susidedančios iš pgsB, pgsC ir pgsA paviršiaus išraiškai; ir geną, koduojantį žmogaus papilomos virusą E7, susijusį su naviko indukcija ir susijusį su sudėtingu poligamma-glutamato sintetazės genu. Rekombinantinės pieno rūgšties bakterijos, transformuotos šiuo vektoriu, gali būti užaugintos ant jų paviršiaus, išrašant antigeninį HP7 E7 baltymą, ir tada tiesiogiai naudojamos kaip vakcina.

                Labiausiai pasirinktas išradimo paviršiaus ekspresijos vektoriaus, skirto gaminti ŽPV vakciną, koduojančią E7 (Rb), antigeninis baltymas yra paviršiaus ekspresijos vektorius, apimantis geną, koduojantį mutantinį artišoko baltymą, turintį SEQ ID Nr. 1 aminorūgščių seką. apima; aldolazės promotorius, gaunamas iš pieno rūgšties bakterijų; kompleksinį poligamama-glutamato sintetazės geną, parinktą iš grupės, susidedančios iš pgsB, pgsC ir pgsA paviršiaus išraiškai; ir geną, koduojantį žmogaus antigeninį baltymo papilomos virusą E7 (Rb), susijusį su naviko indukcija ir sudėtinga polimero gama sintetazės sinteze. Rekombinantinės pieno rūgšties bakterijos, transformuotos šiuo vektoriu, gali būti užaugintos, kad ant jų paviršiaus būtų išreikštas E7 ŽPV (Rb) antigenas, ir tada tiesiogiai naudojamos kaip vakcina.

                Kad vakcina būtų veiksminga gaminant antikūnus, medžiagos antigenai turėtų būti atpalaiduojami in vivo, kad būtų sukeltas antikūnų mechanizmas vakcinuotiems asmenims. Todėl, pageidautina, in vivo turėtų būti įvežtas mikrobinis geno produkto, skirto imuninėms reakcijoms, nešiklis. Norint paskatinti teigiamą atsaką į antigeną, kurį pateikia transformuotos šio išradimo rekombinantinės pieno rūgšties bakterijos, vakcina geriau bus skiriama per burną arba tiesiogiai su gimdos kakleliu, kaip nosies purškalas.

                Geriausia, kai pacientui leidžiama vartoti per burną vakcinos kompoziciją, vakcinos kompozicija yra tiek liofilizuota, pavyzdžiui, kapsulių pavidalu. Kapsulė veikia kaip skrandžio danga, kurioje yra Eudragate S, Eudragate L, celiuliozės acetato, celiuliozės ftalato arba hidroksipropilmetilceliuliozės. Po ištirpinimo kapsulę galima ištirpinti arba sušvirkšti į liofilinę medžiagą, tokią kaip suspensija. Reikėtų redukciją atlikti buferiu, kurio pH yra tinkamas transformuotų rekombinantinių mikroorganizmų išgyvenimui. Norint apsaugoti transformuotą rekombinantinį mikroorganizmą ir skrandžio rūgšties vakciną, prieš kiekvieną vakciną geriau įvesti natrio bikarbonato preparatą. Vakciną galima paruošti parenteraliai, į veną arba į pieną (per krūtį).

                Toliau šis išradimas bus išsamiau paaiškintas pavyzdžiais. Specialistams bus aišku, kad šie pavyzdžiai yra tik iliustratyvūs ir neturi būti aiškinami kaip ribojantys išradimo apimtį. Taigi šie žingsniai yra iliustruojami ir neapriboja išradimo apimties.

                1 pavyzdys: Gaukite paviršiaus ekspresijos vektorių (pKV-Pald-PgsAL-amilazė), kuriame yra mutanto repE genas

                Šiuo atveju buvo sukonstruotas paviršiaus ekspresijos vektorius, kuriame buvo mutavęs repE genas ir padidintas tikslinio baltymo ekspresijos lygis, kad stabilizuotų ekspresijos vektorių šeimininko ląstelėse.

                Pirmiausia buvo gautas aldolazės promotoriaus fragmentas, gautas iš Lactobacillus casei, siekiant dar labiau padidinti tikslinio baltymo ekspresiją pieno rūgšties bakterijose. 2 ir SEQ ID Nr .: Promotorinė aldolazė buvo gauta PCR būdu, naudojant šablonus PDT-PgsA-amilazę (atskleistą Korėjos patentų leidinyje Nr. 10-2008-0086161), geriausia – SEQ ID Nr. 3.

                SEQ ID Nr. 2: 5′-cgc gca tgc aat cac tta ttg cg-3 ‘

                Rezultatas buvo 421 bp ilgio DNR fragmentas, kuriame yra aldolazės promotorius, restrikcijos vieta SphI 5 gale. ‘N-. jungtis pgsA dydis 17 psl. 3’-gale. Be to, mes panaudojome pgsA geno PGR fragmentą, kuris gali būti prijungtas prie aukščiau pateikto, promotoriaus aldolazni fragmentą sudaro PGR, kaip aprašyta aukščiau, kaip šabloną, ypač SEQ ID Nr. 4 ir SEQ ID Nr. 5.

                SEQ ID NO: 4: 5′-gga cta cat gaaaa aga act g-3 ‘

                SEQ ID Nr. 5: 5′-ggc suteikia gggt ggt cgt ttg g-3 ‘

                Gautas DNR fragmentas buvo 782 bp fragmentas, turintis 13 bp. 3 ‘aldolazės promotoriaus gale ir turi tiesiogiai prie jo prijungtą pgsA. Šio fragmento PgsA regione yra ribojančio fermento PstI vieta.

                Du gauti fragmentai buvo tiesiniai ir buvo paveikti PGR, naudojant pradmenis iš abiejų galų, kad būtų gautas 1175 bp DNR fragmentas. DNR fragmentas buvo suskaidytas SphI ir PstI, kad būtų gautas fragmentas, kuriame yra aldolazės promotorius ir N-galo srities pgsA.

                PBT: pgsA-amilazė (PAT Ps1pA-pgsA-amilazė, žr. Netiesioginį Korėjos patentinės paraiškos Nr. 0.872.042 pavyzdį), mes turime virškinimo sistemą su SphI ir PstI, kad pašalintume reklamos sritį SlpA7 ir N galą pgsA sukurti išraiškos vektoriui.

                Promootorinė aldolazė, kurioje yra DNR fragmentas, suskaidytas SphI ir PstI, buvo sujungta su PBT: Ps1pA-amilazė, suardyta tais pačiais restrikcijos fermentais, gaunant PAT-Palden PgsA-amilazę. Vektorius PAT Palden-Pgs-amilazė buvo veikiama miesto nukreiptos mutagenezės, kad būtų pakeistas TTA kodonas, koduojant 475-ąjį aminorūgšties leucino uodegos geną kodono TGA juosta, kad būtų galima atskirti aminorūgšties 21E galinius baltymo REE rūgščius CSR susidarymui. Paletės. PgsA amilazė, turinti aminorūgščių seką SEQ ID Nr. 1 (1).

                2 pavyzdys: paviršiaus išraiškos vektoriaus HPV16 E7 gavimas (pKV-Pald-PgsA-ET)

                Panaudodami paviršinio ekspresijos vektorių (CSR-Palden-PgsA-amilazė), paruoštą 1 pavyzdyje, mes įvedėme geną, koduojantį HPV16 E7 baltymą, į PgsA C galą. Įvedėme CSR-Palden-PgsA-E7 vektorių galintis išskirti tikslinį baltymą pieno rūgšties bakterijų paviršiuje. ,

                Šiuo tikslu geną, amilazę, kuri pilama į pgsA CSR-Palden-PgsA-amilazės vektoriuje, gautą 1 pavyzdyje, ir įterptą vektoriaus geną, koduojantį HPV16 E7. Kaip parodyta 1 paveiksle, fragmentas, kuriame yra HPV16 E7 genas, buvo gautas PGR naudojant Phat: PgsA-E7 (Poo ir kt., Int J. Cancer, 119, 1702, 2006). Kaip šabloną ir SEQ ID NO prajmerje: 6 ir ZAPOR. ID. Nr .: 7

                SEQ ID Nr. 6: 5′-ggg tec cat gga gat acct ttg c-3 ‘

                SEQ ID Nr. 7: 5′-acg cag aag ei ​​tct gat aa-3 ‘

                Dėl to buvo gautas 386 bp fragmentas, turintis HPV16 E7 geną. Fragmentas turėjo restrikcijos fermentą BamHI 5′-gale ir XbaI restrikcijos fermento vietą 3′-gale. Gautas DNR fragmentas suardomas BamHI ir Xbal, gaunant 306 bp fragmentą.

                PKV-Pald-PgsA-amilazės vektorius buvo suskaidytas su BamHI ir XbaI, kad būtų pašalinta amilazės geno dalis, kad būtų vektoriaus fragmentas.

                DNR fragmentas, kuriame yra E7 genas, suskaidytas BamHI ir Xbal, buvo sujungtas su vektoriu, suskaidytas tais pačiais restrikcijos fermentais, kad būtų sukurta CSR-Palden-PgsA-E7 (2A pav.).

                3 pavyzdys: pHAT ekspresija: PgsA-E7 ir pKV-Pald-PgsA-E7 transformuotose pieno rūgšties bakterijose

                Šiuo atveju Lactobacillus casei buvo transformuojami naudojant pHAT: PgsA-E7 ir pKV-Pald-PgsA-E7, sukonstruotus 2 pavyzdyje. Transformuotas rekombinantinis Lactobacillus casei štamas buvo auginamas ir tiriamas E7 baltymo ekspresijai rekombinantiniame štame. PgsA-sujungto E7 baltymo ekspresija buvo tiriama transformuotame rekombinantiniame Lactobacillus casei kamiene.

                Rekombinantinis Lactobacillus casei štamas buvo transformuotas su kiekvienu fatu: PgsAE7 ir CSR-Palden-PgsAE7 buvo auginami MRS terpėje (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson, nuolat auginami bendrovės „Sparks“, JAV) 30 ° C temperatūroje, kad indukuotų paviršiaus HPV167 E7 baltymą. , Poligama-glutamato sintezė, sujungta su pgsA geno C-galu.

                Visos augintos Lactobacillus casei padermės ląstelės buvo tiriamos SDS-poliakrilamido gelio elektroforeze ir Western blot, naudojant PgsA specifinius antikūnus.

                Tiksliau, ištisos ląstelės transformuojamos Lactobacillus casei rekombinantiniu štamu, kuriame indukuojama E7 denatūruoto baltymo geno išraiška yra toje pačioje ląstelių koncentracijoje, kaip ir ruošiant mėginį. Mėginys buvo išanalizuotas naudojant SDS-poliakrilamido gelio elektroforezę, o tada baltymų frakcija buvo perkelta į polivinilideno fluorido-difluorido (PVDF) (Bio-Rad) membraną. PVDF membrana, ant kurios buvo perkeltos baltymų frakcijos, buvo blokuojama 1 valandą purtant blokuojančiame buferyje (50 mM Tris-HCl, 5% nugriebto pieno, pH 8,0), po to 1 valandą inkubuojama su polikloniniu triušiu. PgsA saugomas. Pirminis antikūnas, praskiestas 1000 kartų blokuojančiu buferiu. Po inkubacijos membranos buvo plaunamos buferiu ir 1 valandą inkubuojamos su triušio antriniu antikūnu, konjuguotu su krienų peroksidaze (HRP), praskiestu 10 blokuojančiu buferiu, plaunamas 000 kartų. Inkubacijai pasibaigus, membranos buvo plaunamos buferiu, plaunamos membranomis maždaug 1 minutę, įpylus substrato (Lumigen PS-3 akridanas, H).2O.2) ir specifinis PgsA specifinio antikūno ir sulieto baltymo surišimas buvo stebimas naudojant CCD kamerą (3).

                3 paveiksle C juosta yra transformuota rekombinantiniais Lactobacillus casei štamais, ekspresuojančiais tik PGSA (CSR-Palden-PGSA). 1 linija transformuoja baltymo išraišką iš rekombinantinio Lactobacillus casei padermės su Phat: PGSA-E7, ir 2 juosta parodo rekombinantinio Lactobacillus casei baltymo, transformuoto pKV-Pald-PgsA-E7, ekspresiją. Kaip parodyta 3 paveiksle, 1 ir 2 eilutėse buvo stebimi naudojant antikūnus, specifinius PgsA ekspresijai 54,4 kD PgsA-E7 antikūnui, ir stebėta, kurioje buvo stebimas sulieto baltymo ekspresija PgsA-E7. su CSR-Palden PgsA -E7 genomu. buvo didesnis nei PgsA-E7 sulietų baltymų ekspresija naudojant pHAT geną: PgsA-E7.

                Jei struktūroje PSLP-PgsA-E7 yra fato: PgsA-E7 pakeičia įprastą REE geną, kurį pakeičia pieno rūgšties bakterijos, kurias paverčia Palden-PgsA-E7, negalima gauti, kaip aprašyta aukščiau, kad būtų transformuotos pieno rūgšties bakterijos.

                4 pavyzdys: Gebėjimo sukelti humoralinį imuninį atsaką tarp Lactobacilli padermių, ekspresuojančių HPV16 E7 antigeną ant jų paviršiaus, palyginimas.

                Lactobacillus casei yra transformuojami kiekvienu iš paviršiaus ekspresijos vektorių, o E7-HPC antigeno ekspresija kamienų paviršiuje yra indukuojama tokiu pačiu būdu, kaip 2 pavyzdyje. Vėliau palyginome dviejų tipų transformuotų rekombinantinių Lactobacillus casei padermių tipus su hibridinio baltymo PgsA-BP416 E7 gebėjimu sukelti humoralinį imuninį atsaką. , Po to pelėms buvo duotos dvi padermės su skirtingais sulydytų baltymų ekspresijos lygiais skirtingais kiekiais (1, 1/5 ir 1/10) ir palygintos su gebėjimu sukelti imuninį atsaką.

                Sev Lactobacillus casei buvo transformuoti su kiekvienu iš vektorių, auginami, sumalami ir sublimavę, kad susidarytų dulkės. Milteliai buvo ištirpinti buferiniame tirpale (PBS, pH 7,4) ir po to peroraliai skirti 6 savaičių „Balb“ pelėms.

                Visų pirma, kiekvienas iš užšaldytų džiovintų Lactobacillus casei padermių (Phat-E7 ir CSR-E7) padermių, išreiškiančių ŽPV 16 E7 antigeną, ir Lactobacillus casei padermės (PAT), nepareiškia ištirpinto ŽPV16 E7 antigeno. , PBS skirtingose ​​koncentracijose (PAT) × 109 ląstelės / 200 ml, 1 × 10 9 ląstelės / 200 ml ir 5 × 108 ląstelės / 200 ml) ir pelės, imunizuotos penkis kartus per savaitę 2 savaites (0–4 ir 7 dienos) 11). Po vienos savaitės ji padarė pirmąją revakcinacinę injekciją geriant (21–25 dienas), po vienos savaitės, o antroji injekcija buvo geriama (35–39 dienas). Norėdami išmatuoti EGV-E7 specifinius antikūnus IgG pelių serume ir X-E6 E7 specifinius IgA antikūnus, išskiriamus iš pelių gleivinės, pašalintą žarnyno plovimo buteliuką ir pelių makštį plaunant kiekvieną pelę 14, 28 ir 42 dienas (pav. 4). Tiksliau, kraujas buvo padengtas iš mikrokapiliarinio vamzdelio pelės akies naudojant hepariną, o makšties plovimas žarnyne buvo surinktas 0,8 ml ir 250 ml, naudojant PBS buferį, kuriame buvo 1 mM PMSF. Tada kiekvienas plovimas buvo centrifuguojamas esant 13 000 aps./min. Per 20 minučių supernatantas buvo surinktas ir atliktas ELISA tyrimas.

                ELISA analizei baltymas BPH16 E7 buvo dengimo buferis (0,1 M natrio karbonato, 0,02% natrio azido, pH 9,6), kurio koncentracija 500 ng / 100 L, ištirpinta kiekvienoje duobutėje, o po to 100 ml. praskiedimas buvo pridėtas 96 ml. ELISA plokštelės buvo inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje. ELISA plokštelės tris kartus plaunamos PBST (PBS su 0,05% Tween20), įpilama 300 μl / duobutėje, tada užblokuojama ELISA plokštelėje 100 μl 5%. Nugriebkite pieną 1 valandą 37 ° C temperatūroje, po to pašalinkite blokuojantį buferį. Tada plokštelės patrigubintos PBST ir 100 pm Į plokšteles buvo dedama praskiesto serumo ir gleivinės. Pridedant plokštelę, mėginiai 2 valandas inkubuojami 37 ° C temperatūroje, po to tris kartus plaunami plovimo buferiu. Tada į kiekvieną šulinėlį buvo įpilami ant krienų peroksidazės konjuguoti antikūnai, IgG arba IgA, praskiesti 1: 5000 antikūnais, ir inkubuojami 1 valandą 37 ° C 5M sieros rūgšties 37 ° C temperatūroje. Specifinio antigeno, skirto VRS16 E7, kiekis buvo tiriamas matuojant ELISA metodu esant 450 nm.

                Kaip parodyta 5A pav., Grupėms, gaunančioms pAT-E7 ir pKV-E7, OD reikšmės buvo didesnės nei kontrolinėms grupėms po vidutinio EEG specifinio optinio serumo IgG (OD) optinio tankio (OD) po 2 savaičių imunizacijos. buvo išmatuotas. Pat. Be to, nustatyta, kad E7 specifinių antikūnų skaičius padidėjo priklausomai nuo įvestų padermių skaičiaus. Vidutinė E7 serumo IgG OD vertė po pirmosios pakartotinės injekcijos padidėjo PAT gydomose grupėse ir CSR-E7, palyginti su verte, išmatuota po 2 savaičių imunizacijos, kurioje yra Pakartotinio skiepijimo poveikis rodo. Vidutinis E7 specifinio serumo IgG OD po antrosios revakcinacijos taip pat parodė revakcinacijos poveikį abiejose gydymo grupėse. Visų pirma, grupėje, gaunančioje CSR-E7, kurioje hibridinio E7 baltymo paviršiaus išraiška buvo žymiai didesnė nei grupėje, maitintoje pat-E7, ši grupė į CSR-E7 buvo sušvirkšta 1/5 kiekiu. Tačiau padidėjusio IgG lygio stiprintuvo poveikis yra panašus kaip 1/1 žiurkės E7 grupės.

                Tuo tarpu E7-IgA antikūnų specifinės gleivinės imuninis atsakas žarnyno ir makšties plovime buvo matuojamas ELISA metodu. Dėl to, kaip parodyta 5B ir 5C paveiksluose, vidutinė OD vertė (pvz., Specifinė IgA, būdinga E7) po 2 savaičių imunizacijos abiejose apdorotose grupėse buvo palyginta su PAT-E7 ir CSR-E7. su kontrole. PAT grupė ir E7 specifinių antikūnų kiekis padidėjo atsižvelgiant į įvesto kamieno kiekį. Vidutinis OD po pirmosios revakcinacijos padidėjo, o antrosios revakcinacijos poveikis buvo šiek tiek didesnis nei pirmosios stimuliacinės injekcijos poveikis.

                Baigęs jis gali būti transformuotas su išradimo Lactobacillus casei rekombinantiniais štamais, kad išreikštų HPV16 E7, kuris gali būti skiriamas peroraliai, kad sukeltų humoralinį imuninį atsaką naudojant HPV16 E7 (serumo IgG indukcija) ir gleivinės imuninį atsaką ( Žarnyno / makšties IgA indukcija). Visų pirma, grupė, išreiškianti CSR E7, gautų didesnį E7, galėtų sukelti veiksmingą imuninį atsaką, palyginti su grupe, gavusia patažą E7.

                5 pavyzdys: Gebėjimo indukuoti ląstelių imuninį atsaką tarp Lactobacillus padermių, išreiškiančių jo paviršiuje HPV16 E7 antigeną, palyginimas.

                Ištirta, ar dviejų rūšių transformuotos rekombinantinės Lactobacillus casei padermės (Phat-E7 ir CSR-E7) su skirtingais HPV16 E7 antigeno paviršiaus išraiškos lygiais skiriasi savo gebėjimu atskirti E7 specifinį antigeną nuo imuninio atsako į T CD8 + T ląsteles. ir norint sukelti T7 ir T ląstelių imuninį atsaką, jie buvo atlikti per burną, dažant ląstelių citokinų ir IFN-γ gamybą ELISPOT, naudojant peles, kurios buvo skiriamos su kiekvienu kamienu, kuris ištyrė padermių gebėjimą. Sukelti imuninį atsaką.

                Šiuo tikslu pelėms buvo geriama kiekviena transformuota rekombinantinė Lactobacillus casei padermė, ekspresuojanti E7 ant jų paviršiaus, kaip izoliuota 4 pavyzdyje splenocitais. Splenocitai buvo pasėti 10% RPMI-1640 terpėje su FBS ir suspenduoti 24 duobučiuose, kurių tankis yra 5 x 106 ląstelių / duobutėje. Kiekvienas šulinys buvo apdorotas peptidu E7, turinčiu MHC I klasės epitopą (aminorūgštys 49-57, AniGen, Korėja) ir GolgiPlug (BD Biosciences), ir ląstelės augintos 37 ° C temperatūroje 16 valandų. Kultūros ląstelės buvo dažytos 4 ° C temperatūroje monokloniniu antikūnu CD8 fikoetrinrinimu, esant 4 ° C konjuguotam antivirusiniam antikūnui ir IFN-γ ląstelėse, dažytoms FITC konjuguotomis monokloninėmis žiurkės anti-IFN-γ plokštėmis Cytofix / Naudokite citopermą.

                Kaip aprašyta aukščiau, pelėms išgėrus kiekvieną iš dviejų rekombinantinių Lactobacillus casei, jis buvo nudažytas tarpląsteliniais citokinais, kad būtų galima nustatyti CD7 + T ląstelių, išskiriančių IFN-γ E7, kiekį. Kaip parodyta 6 paveiksle, E7 išreiškia padidėjusį E7 išskiriančių IF8 + T-25 išskiriančių CD8 + T-25 sekretuojančių rekombinantinių Lactobacillus casei štamų įterpimo CD8 + T-25 skaičių. Visų pirma, pradiniame etape, kai jie buvo suaktyvinti su imunine reakcija, buvo aišku, kad ląstelių tarpinamas imuninis atsakas sukėlė Lactobacillus rekombinantinio CSR E7 kamieno kazejas, kurių paviršiaus ekspresija buvo aukštesnė, šiek tiek padidėjo, palyginti su imuninėmis reakcijomis. dėl pHAT pieno rūgšties bakterijų. E7, bet ne imuninis atsakas, kurį sukelia pieno rūgšties sukelta ląstelių tarpinė revakcinacija Phat-E7 padidėjo iki lygio, panašaus į CSR-E7 kamieną.

                Norėdami ištirti imuninių reakcijų į E7 specifinių T ląstelių indukciją, atlikome ELNSPOT IFN-y testą, kad įvertintume bendrą T ląstelių, kurios specialiai išskiriamos IFN-γ, skaičių, atsižvelgiant į E7 peptido stimuliavimą. , Tam tikslui, vieną dieną prieš išskiriant 24 šulinėlių splenocitus, padengtus įdomiu pelės anti-IFN-γ antikūnu ir eksperimento dieną išskirtus splenocitais, jie buvo pasėti kiekviename plokštelės šulinyje po 2 x 105 ląsteles. / Depresijos. Kiekvienas nusodintų ląstelių šulinys buvo apdorotas peptidu E7 arba PHA-M ir ląstelės buvo kultivuojamos 2 dienas. Po 2 dienų tablečių turinys pašalinamas ir du kartus inkubuojamas su distiliuotu vandeniu ir tris kartus su 0,05% PBS, Tween-20, po to biotinilintu anti-INF-y kiekviename tabletės šulinyje ir 2 valandas kambario temperatūroje. Po inkubacijos plokštelių turinys pašalinamas, kiekvienas šulinys tris kartus plaunamas 0,05% Tween-20 PBS, po to streptavidin-HRP plaunamas kambario temperatūroje 1 valandą kiekviename plokštelės šulinyje ir inkubuojamas. Tada tablečių turinys buvo išmestas ir kiekvienas šulinys keturis kartus buvo plaunamas 0,05% PBS, turinčiu nuo 20 iki 2 kartų su PBS. Tada mes pridėjome substrato prie kiekvieno šulinio ir pamatėme, kaip kiekviename šulinyje atsirado spalvos nuo 5 iki 60 minučių. Spalvos vystymosi reakcija buvo sustabdyta distiliuotu vandeniu ir, naudojant ELISPOT, buvo išmatuotas dėmių skaičius kiekviename šulinyje.

                Kaip parodyta 6 pav., Pelės buvo gydomos rekombinantinėmis pieno rūgšties bakterijomis, transformuotomis Phat-E7 arba CSR-E7, jos padidino ląstelių, kurios specifiškai išskiria IFN-γ peptide E7, skaičių. Be to, ląstelių, kuriose yra IFN-γ, skaičius CSR-E7, šiek tiek didesnis nei IFN-γ ląstelių skaičius toje grupėje, kuri gavo rekombinantinį štamą, buvo transformuotas rekombinantiniais Lactobacillus kamienais. kazei, Lactobacillus casei, paversti pHAT. E7.

                6 pavyzdys. Lactobacillus imunizuotų pelių, auginančių ant jų paviršiaus HP7 E7 antigeną, navikinių ląstelių išprovokacija

                Norint patvirtinti dviejų tipų rekombinantinių padermių, prieštankinį poveikį, Lacfobacillus (Granular-E7 ir CSR-E7), turinčius skirtingą HPV16 E7 antigeno paviršiaus išraiškos lygį ir antivėžinį poveikį, atsižvelgiant į jų skaičių Norėdami patvirtinti, jie buvo veikiami naviko ląstelių, kad susidarytų navikas. TC-1 ląstelės, ekspresuojančios E7 baltymą.

                Šiuo tikslu C57BL / 6 pelių patelės, pagyvenusios 6–8 savaites ir suskirstytos į kelias grupes, kiekviena susideda iš 5 gyvūnų, ir kiekviena iš Lactobacillus casei rekombinantinių padermių yra transformuotos, išreikšdamos jų paviršiuje E7, oraliniu būdu. skiriama pelėms. Peroralinis gydymas buvo atliekamas penkis kartus per savaitę, o pelės buvo gydomos pagal šį grafiką: 1 savaitė peroraliai, 1 savaitės poilsis, po to 1 savaitė po pirmosios pagreičio injekcijos, po to 1 savaitė poilsio ir dar 1 savaitė kitos stimuliacijos injekcijos. , Po 1 savaitės, kai buvo sušvirkšta 10 žodžių, 2 x 4 TC-L naviko ląstelės švirkščiamos po oda į kiekvienos pelės kairę šlaunį, kad sukeltų navikus. Gautas naviko dydis buvo matuojamas tris kartus per savaitę, naudojant žandikaulį.

                Kaip parodyta 7 paveiksle, grupėje, kurioje jie žodžiu vartojo rekombinantinį Lactobacillus casei štamą, maždaug 50 procentų transformuoto Phat-E7 arba CSR-E7 naviko dydis buvo mažesnis nei kontrolinės grupės naviko dydis. Be to, grupėje, kuriai jie švirkščiami su CSR-E7 Lactobacillus casei rekombinantiniu kamienu, sumažintu 1/5 tūriu, naviko dydis yra mažesnis nei kontrolinėje grupėje.

                7 pavyzdys: Imunizuotų pieno rūgšties bakterijų (CSR-Palden-PgsA-E7 (Rb)), išreiškiančių jų paviršiuje baltymą, aminorūgščių mutaciją, esančią 16 vietoje į ŽPV tipą, paruošimas, E7

                Kai ląstelės yra užkrėstos papilomos virusu, jos gali būti ekspresuojamos. E7 jungiasi su baltymu, kuris slopina retinoblastomos (pRb) augimą, dėl kurio atsiranda vėžys. Tuo tikslu į pagrindinę E7 sekos seką buvo įvestos pRB surišančios srities mutacijos. Genas, kurį sukėlė E7 (Rb) mutacija, buvo sulietas PgsA gale naudojant pKV šaudyklinį vektorių, kuris yra nuolat ekspresuojamas Escherichia coli ir pieno rūgštimis, į pKV-Pald PgsA-E7 (Rb) vektorių forma, kuri yra išraiškinga paviršiuje. Pieno rūgštis. Bakterijų.

                Tyrimo rezultatai atskleis Rb baltymo jungimosi vietas, turinčias E7 tipo papilomos virusą, kuris jungiasi su retinoblastomos baltymo (Rb) (DL × C × E) inhibitoriais, susidedančiais iš E7 geno 21–26 aminorūgščių liekanų iš ŽPV-16 (Mahmoud ir kt., Virology, 281: 231 (2001)) visoms 21 (D), 24 (C) ir 26 (E) aminorūgštims tarp glicino 21–26 aminorūgščių liekanų, baltymo gebėjimui. E7, kuris jungiasi su baltymu, jungiančiu pRb, eliminuoja taško mutagenezę, naudodamas prajmovą. Visų pirma, PGR buvo gauta naudojant CSR-Palden-PgsA-E7 vektorių 2 pavyzdyje kaip šabloną ir kiekvieną prajmovo rinkinį SEQ ID NOS. 8 ir 9 bei sakinys prajmov SEQ ID NO: 10 ir 11.

                SEQ ID Nr. 8: 5′-tct gga tcc atg cat cat ga cct ac-3 ‘

                SEQ ID NO: 9: 5′-ttg ccc ata g a t t c-3 ‘

                SEQ ID NO: 10: 5′-nude ggt ctc tac ggt tat ggg caa tta aat g-3 ‘

                Sek.-ID Nr. 11: 5′-katė iš viso aga tta tta tgg ttt ctg aga aca g-3 ‘

                Dėl to, naudodamiesi prajmovo SEQ ID Nr. 8 ir 9, mes randame 87 bp ilgio DNR fragmentą, kuriame yra E7 genas iš HPV16 ir restrikcijos fermento BamHI 5′-galas. Be to, mes naudojame prajmovo SEQ ID Nr. 10 ir 11 249 bp DNR fragmentą, kuriame yra restrikcijos fermento XbaI vieta 3′-gale. Du gauti DNR fragmentai sumaišomi kartu ir per 10 PGR ciklų sudarė 30 sekundžių 95 ° C, 30 sekundžių 42 ° C ir 30 sekundžių 72 ° C temperatūroje. Tada pereikite prie SEQ. ID. 8 ir 11 ir PGR buvo pakartoti (95 ° C temperatūroje 30 sekundžių, 53 ° C temperatūroje 30 sekundžių ir 72 ° C temperatūroje 30 sekundžių). Gautas DNR fragmentas 312 p. viename restrikcijos fermento BamHI paviršiuje yra 5 ‘gale, o Xba I restrikcijos fermento vieta yra 3’ gale. Fragmentas buvo suskaidytas restrikcijos fermentais BamHI ir Xbal, gaunant 306 bp E7 (Rb) mutanto geno fragmentą. CSR-Palden-PgsA-amilazė buvo virškinama su BamHI ir XbaI dalimi geno, kad būtų pašalinta amilazė, kad būtų gauta vektoriaus dalis. DNR fragmentas, kuriame yra mutanto E7 (Rb) genas, suskaidytas BamHI ir Xbal, buvo surištas į vektorių, suskaidytas tais pačiais restrikcijos fermentais, kad būtų gauta CSR-Palden-PgsA-E7 (Rb) (8 paveikslas). statyti.

                PKV-Pald-PgsA-E7 (Rb) konstruktas buvo elektroporuotas į Lactobacillus atvejį, kad būtų pagamintos pieno rūgšties bakterijos, transformuotos šiuo konstruktu.

                8 pavyzdys: pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb) raiškos tyrimas transformuotose pieno rūgšties bakterijose

                Ištirti, ar hibridinis baltymas PgsA-E7, turintis mutaciją jungimosi vietoje B, išreikštas rekombinantiniame Lactobacillus casei, yra transformuotas naudojant CSR-Palden-PgsA-E7 (Rb) vektorių ekspresijai pieno pieno rūgšties bakterijų paviršiuje Kitas bandymas buvo atliktas.

                Transformuoti rekombinantiniai Lactobacillus casei buvo auginami MRS terpėje (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson) Sparks Company, JAV) 30 ° C temperatūroje, mikrobų ląstelės kaupiasi ir analizuoja Western blot tokiu pačiu būdu kaip 3 pavyzdyje. Rezultatas buvo gautas. patvirtintas hibridinis baltymas buvo ekspresuotas šioje mikrobų padermėje. Tiksliau, atliekamas Western blotting, nustatomi antikūnai, būdingi E7 PgsA, ir antikūnai, būdingi ŽPV16 (E7 monokloninis antikūnas, Invitrogen, JAV), ir dėl to, kaip parodyta 9 paveiksle, mutanto baltymo E7 ekspresija. patvirtino. apie 54,7 kDa sujungta su PgsA.

                9 pavyzdys Imunologinių reakcijų į laktobacilų, ekspresuojančių ant jų paviršiaus mutanto HPV16 E7 (Rb) antigeną, indukcija

                Rekombinantinis Lactobacillus casei štamas, kuris, kaip patvirtinta, ekspresuoja mutantinį E7 baltymą, sulietą su PgsA, buvo išgertas pelėms, kad ištirtų galimybę sukelti humorinį imuninį atsaką. Tuo tikslu Lactobacillus casei buvo transformuoti vektoriu, auginami ir po to liofilizuojami, kad būtų gauti milteliai. Milteliai buvo ištirpinti buferiniame tirpale (PBS, pH 7,4) ir išgerti 6 savaičių „Balb / c“ pelėms.

                Be to, transformuotas rekombinantinis Lactobacillus casei (E7-Rb) štamas, išreikštas HPV16 E7 (Rb), ir Lactobacillus casei (L525) štamas, kuris ekspresuoja HPV16 E7 (Rb), esant PBS koncentracijai, išreiškia nespecifinį, 2–5 x 109 ląstelių / 200 ml ir po to penkis kartus imunizuotos pelės per savaitę 2 savaites (0–4 ir 7–11 dienos). Po vienos savaitės pirmoji pagreitinta injekcija buvo peroralinė (21–25 dienos) ir antroji peroralinė injekcija (35–39 dienos) po pirmosios savaitės. Norėdami išmatuoti EGV-E7 specifinius antikūnus IgG pelių serume ir X-E6 E7 specifinius IgA antikūnus, kurie išsiskiria iš pelių gleivinės, pašalindami pelių žarnyną ir makštį, visus 14, 28 ir 28 42, pvz. nurodyta. Kaip aprašyta 4 pavyzdyje, jis buvo gautas iš pelės akies kraujo, naudojant mikrokapiliarinį vamzdelį, padengtą heparinu, žarnos ir žarnyno plovimas buvo surinkti 0,8 ml arba 250 μl, PBS buferio, turinčio 1 mM PMSF. Kiekvienas surinktas skalbinys 20 minučių buvo centrifuguojamas esant 13 000 aps./min., O supernatantas buvo surinktas ir išanalizuotas ELISA metodu tokiu pat būdu, kaip ir ketvirtojo atveju.

                Dėl to, kaip parodyta Fig. 10A, kai tai yra grupė E7-Rb, skiriama praėjus 2 savaitėms po imunizacijos, norint išmatuoti E7 specifinį serumo IgG vidutinį optinį tankį (OD), nustatyta didesnė OD vertė nei L525 (neigiama kontrolė) ). OD vidutinis serumo IgG, būdingas E7, po pirmosios revakcinacijos, palygino E7 Rb grupę su išmatuotomis po 2 savaičių imunizacijos, parodydamas pakartotinės vakcinacijos poveikį. E7 specifinis vidutinis OG serume IgG taip pat parodė pakartotinės vakcinos poveikį. Tačiau grupė, vartojanti L525, specifinio povakcinavimo poveikio neparodė. Be to, norint išmatuoti gleivinės sukeltą humorinį imuninį atsaką, buvo išmatuotas kiekvieno žarnos ir makšties spiralės specifinio IgA antikūno ELISA. Dėl to, kaip parodyta Fig. 10B ir 10C paveikslai 10C temperatūroje vidutinis OD (specifinis E7 IgA) po dviejų savaičių imunizacijos padidėjo E7 Rb grupėje, palyginti su L525 (neigiama kontrolė). Be to, padidėjęs vidurkis nuo pirmosios pakartotinės injekcijos, palyginti su išmatuota verte po 2 savaičių imunizacijos, padidino kitų stimulų injekcijų poveikį, palyginti su stimuliuojančiu pirmosios injekcijos poveikiu.

                Išgertas Lactobacillus casei pelių rekombinantinis E7-Rb štamas gali sukelti visus sisteminius humoralinius imuninius atsakus (IgG serumo indukcija) ir HRFC16-E7 specifinius humorinius imuninius atsakus (IgA žarnos / makšties indukcija). ,

                10 pavyzdys: Lactobacillus ląstelių imuninių atsakų, indukuojančių mutantinį antigeną HPV16 E7 (Rb) ant jo paviršiaus, indukcija

                Norėdami išsiaiškinti, ar transformuotas rekombinantinis laktobacilų štamas (E7-Rb) paviršiaus specifiškumui nustatyti E-specifiniam antigenui (Rb) būdingą imuninį atsaką ekspresuoja T ląstelių tarpininkaujantį mutantinį HPV16 E7 antigeną, IFN buvo atliktas -γ. ELISPOT naudojo pelėms, peroraliai šiam kamienui, ir patikrino jų sugebėjimą iššaukti ląstelių imuninį atsaką. Šiuo tikslu yra transformuojamas rekombinantinis Lactobacillus casei štamas, kuris ant jo paviršiaus apdoroja mutanto E7 antigeną HPV16 (Rb), pagamintą 7 pavyzdyje, išreikštą oraliniu būdu su pele, po to išskiriant iš pelių miltus. Atrinkti splenocitai buvo suspenduoti RPMI 1640 terpėje, turinčioje 10% FBS, ir pasėti kiekviename 24 vdolbinicno plokštelės šulinyje, esant 5 x 10 ląstelių tankiui. Kiekvienas šulinys buvo apdorotas peptidu E7, turinčiu MHC I klasės epitopą (aminorūgštys 49-57, AniGen, Korėja) ir GolgiPlug (BD Biosciences), ir ląstelės augintos 37 ° C temperatūroje 16 valandų. Pasodintos ląstelės 40 minučių buvo dažytos monokloniniu antikūnų antikoetrino (PE) anti-pelės CD8, esant 4 ° C, ir IFN-γ ląstelėse buvo inkubuotos su FITC konjuguotais anti-pelių IFN-γ monokloniniais antikūnais, naudojant rinkinį Cytofix / citopermas dažytas.

                Kaip aprašyta aukščiau, mes turėjome rekombinantinius Lactobacillus casei štamus, kurie buvo švirkščiami kiekvienai pele, o vėliau buvo tarpląstelinių citokinų dažymas, siekiant nustatyti E7 (Rb) specifinių CD8 + T ląstelių, kurioms IFN-γ, skaičių. išskirti. Kaip parodyta 6 paveiksle, įvedus transformuotus rekombinantinius Lactobacillus e1 atvejo (E) štamus, išreiškiančius Rb, padidėjo E7 skaičius (specifinis IFN-γ, išskiriantis CD8 + T-25, sekretuojančias ląsteles, išskiria CD8 + T-25). Visų pirma, pradiniame etape, kuriame jis yra sukeltas imuninis atsakas, buvo aišku, kad imuninis atsakas, gautas rekombinantinio CSR-E7 (Rb), Lactobacillus casei, kuris turėjo aukštesnį paviršiaus išraiškos laipsnį, šiek tiek padidėjo, palyginti su imuniniu atsaku. Fermentacija PHAT-E7 (Rb), bet ne ląstelių tarpinamas imuninis atsakas, kurį sukelia pieno rūgšties bakterijos PHAT-E7 (Rb), kuris po akseleratoriaus įšvirkštimo pasiekė panašų lygį kaip CSR-E7 (Rb).

                Norint ištirti imuninių reakcijų į E7 specifines T ląsteles indukciją, buvo atliktas ELNPOT-IFN-γ tyrimas, siekiant įvertinti bendrą T ląstelių, išskiriančių IFN-γ specialiai E7 peptido stimuliacijai, skaičių.

                Tam tikslui, vieną dieną prieš išskiriant 24 šulinėlių splenocitus, padengtus įdomiu pelės anti-IFN-γ antikūnu ir eksperimento dieną išskirtus splenocitais, jie buvo pasėti kiekviename plokštelės šulinyje po 2 x 105 ląsteles. / Depresijos. Kiekvienas nusodintų ląstelių šulinys buvo apdorotas peptidu E7 arba PHA-M ir ląstelės buvo kultivuojamos 2 dienas. Po 2 dienų tabletės turinys pašalinamas ir du kartus plaunamas distiliuotu vandeniu ir tris kartus 0,05% PBS, Tween-20, po to biotiniliuotu anti-pelės IFN-γ kiekviename tabletės šulinyje ir 2 valandas kambario temperatūroje. būti inkubuotas. Po inkubacijos plokštelių turinys pašalinamas, kiekvienas šulinys tris kartus plaunamas 0,05% Tween-20 PBS, po to streptavidin-HRP plaunamas kambario temperatūroje 1 valandą kiekviename plokštelės šulinyje ir inkubuojamas. Tada tablečių turinys buvo išmestas ir kiekvienas šulinys keturis kartus buvo plaunamas 0,05% PBS, turinčiu nuo 20 iki 2 kartų su PBS. Tada mes pridėjome substrato prie kiekvieno šulinio ir pamatėme, kaip kiekviename šulinyje atsirado spalvos nuo 5 iki 60 minučių. Spalvos vystymosi reakcija buvo sustabdyta distiliuotu vandeniu ir, naudojant ELISPOT, buvo išmatuotas dėmių skaičius kiekviename šulinyje.

                Kaip parodyta 11 pav., Kad pelės buvo užaugintos rekombinantinėmis pieno rūgšties bakterijomis, paruoštomis su Phat-E7 (Rb) arba CSR-E7 (Rb), padidėjęs ląstelių skaičius išskiriamas specifiniu peptidu E7, IFN-γ. , Be to, ląstelių, gaunančių IFN-γ, skaičius sezerių grupėje, gavusioje rekombinantinį Lactobacillus casei štamą, yra paverčiamas CSR-E7 (Rb), kuris yra šiek tiek didesnis nei ląstelių skaičius jos grupės IFN-γ kuris yra žiurkėmis transformuotas rekombinantinis Lactobacillus casei štamas. -E 7 (Rb).

                Nors šis išradimas buvo išsamiai aprašytas atsižvelgiant į specifinius požymius, specialistams bus suprantama, kad šis aprašymas taikomas tik pageidaujamam termino įgyvendinimui ir neriboja išradimo apimties.

                Kaip aprašyta aukščiau, rekombinantinės pieno rūgšties bakterijos, transformuotos į šio išradimo paviršiaus ekspresijos vektorių, gali ekspresuoti žmogaus antigeno viruso papilomos virusą (ŽPV) paviršiuje, o kompozicija, kurioje aktyviosios sudedamosios dalys yra rekombinantinės pieno rūgšties bakterijos, gali būti naudojama kaip gydymo vakcina Gimdos kaklelio vėžys. Rekombinantinis rekombinantinis štamas, kuris sudaro aukštą ŽPV antigeno kiekį, yra labai efektyvus, nes jį galima dauginti dideliais kiekiais ir skirti kaip geriamąją vakciną arba tiesiai į makštį.

                Leave a Reply